非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法

微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數(shù)。 當本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合規(guī)定的微生物限度標準

時，應按下述規(guī)定進行檢驗，包括樣品的取樣量和結果的判斷等。除另有規(guī)定外， 本法不適用于活菌制劑的檢查。

本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動檢測方法，但必須證明替代 方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。

微生物計數(shù)試驗應在受控潔凈環(huán)境環(huán)境潔凈度 10 000 級下的局部潔凈度不 低于 B100 級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防 止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、 工作臺面及環(huán)境應定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的 測試方法》的現(xiàn)行國家標準進行監(jiān)測。

如供試品有抗菌活性，應盡可能去除或中和。供試品檢查時, 若使用了中和 劑或滅活劑，應確認其有效性及對微生物無毒性。

供試液制備時如果使用了表面活性劑，應確認其對微生物無毒性以及與所使 用中和劑或滅活劑的相容性。

計數(shù)方法 計數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和zui可能數(shù)法（Most-Probable-Number

Method，簡稱 MPN 法）。MPN 法用于微生物計數(shù)時度較差，但對于某些微 生物污染量很小的供試品，MPN 法可能是更適合的方法。

供試品檢查時, 應根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標準等因素選擇計數(shù) 方法，同時所選的方法的供試品用量必須具備檢測充足樣品量的能力，能夠以保 證所獲得的試驗結果能夠判斷供試品是否符合規(guī)定。所選方法的適用性須經(jīng)確 認。

計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計數(shù)方法適用性試驗 供試品微生物計數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應進行適用性檢查。 供試品的微生物計數(shù)方法應進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合

于該產(chǎn)品的微生物計數(shù)。

若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結果時，計數(shù)方法應重新進行適用

性試驗。

表 1   試驗菌液的制備和使用

注：當需用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測定霉菌和酵母菌總數(shù)時，應進行培養(yǎng)基靈敏度檢查， 檢查方法同沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

菌種及菌液制備

菌種  試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過 5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌

種為第 0 代），并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學 特性。計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計數(shù)方法適用性試驗用菌株見表 1。

菌液制備 按表 1 規(guī)定程序培養(yǎng)各試驗菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單 胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨 緩沖液或 0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物 加入 3～5ml 含 0.05％聚山梨酯 80 的 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或 0.9% 無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管 內(nèi)，用含 0.05％聚山梨酯 80 的 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或 0.9%無菌氯 化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。

菌液制備后若在室溫下放置，應在 2 小時內(nèi)使用；若保存在 2～8℃，可在 24 小時內(nèi)使用。穩(wěn)定的黑曲霉孢子懸液可保存在 2～8℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使 用。

陰性對照 為確認試驗條件是否符合要求，應以稀釋劑代替供試品進行陰性對照試驗，

陰性對照試驗應無菌生長。供試品檢查時也需進行陰性對照試驗。如果陰性對照 有菌生長，應進行偏差調(diào)查。

培養(yǎng)基適用性檢查 微生物計數(shù)用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應進行

培養(yǎng)基適用性檢查。

按表 1 規(guī)定，接種不大于 100cfu 的菌液至胰酪大豆胨肉湯管或胰酪大豆胨 瓊脂平板培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基，置表 1 規(guī)定條件下培養(yǎng)。每一試

驗菌株平行制備 2 管或 2 個平皿。同時，用相應的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進 行上述試驗。

被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應在 0.5-2 范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基 管與對照培養(yǎng)基管比較，試驗菌應生長良好。

計數(shù)方法適用性試驗

⒈供試液制備

根據(jù)供試品的理化特性與生物學特性,采取適宜的方法制備供試液。供試液

制備若需加溫時,應均勻加熱,且溫度不應超過 45℃。供試液從制備至加入檢驗 用培養(yǎng)基,不得超過 1 小時。

常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經(jīng)確認均不適用，應 建立其他適宜的方法。

⑴ 水溶性供試品 取供試品，用 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或 pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基溶解或稀釋制成 1:10 供試液。 若需要，調(diào)節(jié)供試液 pH 值至 6～8。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步 10 倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。

⑵ 水不溶性非油脂類供試品 取供試品，用 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩 沖液，或 pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基制備成 1:10 供試液。 分散力較差的供試品，可在稀釋劑中加入表面活性劑如 0.1%的聚山梨酯 80，使 供試品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液 pH 值至 6～8。必要時，用同一稀釋液將 供試液進一步 10 倍系列稀釋。

⑶  油脂類供試品  取供試品，加入經(jīng)過濾除菌的十四烷酸異丙酯使溶解， 或與zui少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯 80 或其他無抑菌性的無菌表面活 性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過 40℃（特殊情況下，zui多不超過 45℃），小心混合，若需要可在水浴中進行，然后加入預熱的稀釋劑使成 1∶10 供試液，保溫，混合，并在zui短時間內(nèi)形成乳狀液。必要時，用含適宜濃度的無 菌聚山梨酯 80 或其他無抑制性無菌表面活性劑的稀釋劑進一步 10 倍系列稀釋。

⑷需用特殊方法制備供試液的供試品

膜劑供試品  取供試品,剪碎,加 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或 pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基，浸泡，振搖，制備成 1∶10 的供試液。 若需要，調(diào)節(jié)供試液 pH 值至 6～8。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步 10 倍系列稀釋。

腸溶及結腸溶制劑供試品 取供試品，加入 pH6.8 無菌磷酸鹽緩沖液（用于 腸溶制劑）或 pH7.6 無菌磷酸鹽緩沖液（用于結腸溶制劑），置 45℃水浴中,振 搖,使溶解,制備成 1∶10 的供試液。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步 10 倍系列稀釋。

氣霧劑、噴霧劑供試品  取供試品,置冰凍室冷凍約 1 小時，取出，迅速消

毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動容器， 使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器從每一容器中吸出全部藥液于無菌容器中 混合，然后取樣檢查。

貼膏劑供試品 取供試品,去掉防粘層，將粘貼面朝上放置在無菌玻璃或塑 料器皿上，在粘貼面上覆蓋一層適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布），避免貼膏 劑粘貼在一起。將處理后的貼膏劑放入盛有適宜體積并含有表面活性劑（如聚山 梨脂 80 或卵磷脂）稀釋液的容器中，振蕩至少 30 分鐘。必要時，用同一稀釋液

將供試液進一步 10 倍系列稀釋。

⒉  接種和稀釋 按下列要求進行供試液的接種和稀釋,制備微生物回收試驗用供試液。所加

菌液的體積應不超過供試液體積的 1%。為確認供試品中的微生物能被充分檢出， 首先應選擇zui低稀釋級的供試液進行計數(shù)方法適用性試驗。

（1） 試驗組 取上述制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻，使每 1ml 供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于 100cfu。

（2） 供試品對照組  取制備好的供試液, 以稀釋液代替菌液同試驗組操

作。

（3）菌液對照組   取不含中和劑及滅活劑的相應稀釋液替代供試液,按試驗

組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。

若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е?s>所無法選擇采用zui低稀釋級 的供試液計數(shù)方法不能通過進行方法適用性試驗時，應采用適宜的方法對供試液 進行進一步的處理。如果供試品對微生物生長的抑制作用仍無法以其他方法消 除，供試液可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試驗菌懸液進行方法適應 性試驗。

⒊  抗菌活性的去除或滅活 供試液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進行微生物計數(shù)。若試驗

組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與小于菌液對照組的比值不在 0.5-2 范 圍內(nèi)菌數(shù)值的 50%，可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。

⑴  增加稀釋液或培養(yǎng)基體積.

⑵  加入適宜的中和劑或滅活劑。

中和劑或滅活劑（表 2）可用于消除抗菌劑的抑菌活性， 在稀釋劑或

培養(yǎng)基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，試驗中應設中和劑或滅活劑對照組， 即取相應量稀釋液替代供試品同試驗組操作，以確認其有效性和對微生物無毒 性。中和劑或滅活劑對照組的菌落數(shù)與菌液對照組的菌落數(shù)的比值應在 0.5～2 范圍內(nèi)。

表 2 常見干擾物的中和劑或滅活方法

⑶  采用薄膜過濾法。

⑷  上述幾種方法的聯(lián)合使用。 若沒有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對特定試驗菌回收的失敗，表明供

試品對該試驗菌具有抗菌活性，同時也表明供試品不可能被該類微生物污染。但 是，供試品也可能僅對特定試驗菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。 因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標準和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢驗結果 判斷的前提下，應采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行計數(shù)方法適用 性試驗。若方法適用性試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為zui低稀釋級的供 試液進行供試品檢查。

⒋  供試品中微生物的回收

表 1 所列的計數(shù)方法適用性試驗用的各試驗菌應逐一進行微生物回收試驗。

微生物的回收可采用平皿計數(shù)法、薄膜過濾法或 MPN 法。

⑴ 平皿計數(shù)法 平皿計數(shù)法包括傾注法和涂布法。表 1 中每株試驗菌每種 培養(yǎng)基至少制備 2 個平皿，以算術均值作為計數(shù)結果。

傾注法   取照上述“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消 除”制備的供試液 1ml，置直徑 90mm 的無菌平皿中, 注入 15～20ml 溫度不超過 45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。 若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應相應增加。按表 1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。 同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。計算各試驗組的平均菌落數(shù)。

涂布法 取 15～20ml 溫度不超過 45℃的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂 培養(yǎng)基，注入直徑 90mm 的無菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng) 基表面干燥。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也應相應增加。每一平皿表面 接種上述照“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備的供 試液不少于 0.1ml。按表 1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液 對照組菌數(shù)。計算各試驗組的平均菌落數(shù)。

⑵ 薄膜過濾法 薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應不大于 0.45μ m,直徑一 般為 50mm,若采用其他直徑的濾膜,沖洗量應進行相應的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時 應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應采用適 宜的方法滅菌。使用時,應保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前 先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品,其濾膜和濾器在使用前應充分 干燥。為發(fā)揮濾膜的zui大過濾效率,應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾 膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量為 100ml?？倹_洗量不得超過 1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。

取照上述 “供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備 的供試液適量（一般取相當于 1g、1ml 或 10cm2 的供試品, 若供試品中所含的菌 數(shù)較多時，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中,混勻,過濾。用適量的沖 洗液沖洗濾膜。

若測定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上； 若測定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。按表 1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。每株試驗菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。同法測

定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。

⑶  MPN 法  MPN 法的精密度和準確度不及薄膜過濾法和平皿計數(shù)法，尤其 是用于霉菌計數(shù)，其結果是不可信的。因此，MPN 法僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有 適宜計數(shù)方法的情況下使用，本法不適用于霉菌計數(shù)。若使用 MPN 法，按下列步 驟進行。

取照上述 “供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備 的供試液至少 3 個連續(xù)稀釋級，每一稀釋級取 3 份 1ml 分別接種至 3 管裝有 9～ 10ml 胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基中，同法測定菌液對照組菌數(shù)。必要時可在培養(yǎng)基 中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。

接種管置 30～35℃培養(yǎng) 3 天，逐日觀察各管微生物生長情況。如果由于供 試品的原因使得結果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基或 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng) 1～2 天，觀察是否有微生物生長。 根據(jù)微生物生長的管數(shù)從表 3 查對被測供試品每 1g 或每 1ml 中總需氧菌的zui可 能數(shù)。

表 3 微生物zui可能數(shù)檢索表

注：表內(nèi)所列檢驗量如改用 1g（或 ml）、0.1g（或 ml）和 0.01g（或 ml）時，表內(nèi)數(shù)字應

相應降低 10 倍；如改用 0.01 g（或 ml）、0.001 g（或 ml）和 0.0001 g（或 ml）時，表 內(nèi)數(shù)字應相應降低增加 10 倍，其余類推。

⒌  結果判斷 計數(shù)方法適用性試驗中，采用薄膜過濾法或平皿計數(shù)法時，試驗組菌落數(shù)減

去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應在 0.5～2 范圍內(nèi)；采 用 MPN 法，試驗組菌落數(shù)應在菌液對照組菌落數(shù)的 95%置信限內(nèi)。若各試驗菌的 回收試驗均符合要求，照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進行該供試品的需氧 菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。

方法適用性確認時,若采用上述方法還存在一株或多株試驗菌的回收達不 到要求,那么選擇回收zui接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢查。

供試品檢查

檢驗量

檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml 或 cm2）。 除另有規(guī)定外,一般供試品的檢驗量為 10g 或 10ml；膜劑為 100cm2；貴重藥

品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。檢驗時,應從 2 個以上zui小包裝單位中抽

取供試品,大蜜丸還不得少于 4 丸,膜劑還不得少于 4 片。 一般應隨機抽取供試品，取規(guī)定容器數(shù)，混合，取規(guī)定量供試品進行檢驗。 供試品的檢查 按計數(shù)方法適用性試驗確認的計數(shù)方法進行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵

母菌總數(shù)的測定。 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基用于測定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測

定霉菌和酵母菌總數(shù)。

陰性對照試驗  以稀釋劑代替供試液進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應無 菌生長。如果陰性對照有菌生長，應進行偏差調(diào)查。

⒈ 平皿計數(shù)法 平皿計數(shù)法包括傾注法和涂布法。除另有規(guī)定外，取規(guī)定量供試品，按方法

適用性試驗確認的方法進行供試液制備和菌數(shù)測定，每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制 備 2 個平皿。

培養(yǎng)和計數(shù)  除另有規(guī)定外，胰酪大豆胨瓊脂平板在 30～35℃培養(yǎng) 3-5 天， 沙氏葡萄糖瓊脂平板在 20～25℃培養(yǎng) 5-7 天， 觀察菌落生長情況,點計平板上 生長的所有菌落數(shù)并報告。菌落蔓延生長成片的平皿不宜計數(shù)。點計菌落數(shù)后， 計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。若同稀釋級兩個 平皿的菌落數(shù)平均值不小于 15，則兩個平皿的菌落數(shù)不能相差 1 倍或以上。

菌數(shù)報告規(guī)則  需氧菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于 300cfu 的稀釋級、 霉菌和酵母菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于 100cfu 的稀釋級，作為菌數(shù)報告

（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。取zui高的平均菌落數(shù)，計算 1g、1ml 或 10cm2 供試 品中所含的微生物數(shù)。

如各稀釋級的平皿均無菌落生長，或僅zui低稀釋級的平板有菌落生長，但 平均菌落數(shù)小于 1 時，以﹤1 乘以zui低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。

⒉  薄膜過濾法

除另有規(guī)定外，按計數(shù)方法適用性試驗確認的方法進行供試液制備。取相當

于 1g、1ml 或 10cm2 供試品的供試液，若供試品所含的菌數(shù)較多時，可取適宜稀 釋級的供試液，照方法適用性試驗確認的方法加至適量稀釋液中，立即過濾，沖 洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培 養(yǎng)基上培養(yǎng)。

培養(yǎng)和計數(shù) 培養(yǎng)條件和計數(shù)方法同平皿計數(shù)法，每張濾膜上的菌落數(shù)應不 超過 100cfu。

菌數(shù)報告規(guī)則 以相當于 1g、1ml 或 10cm2 供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)；若濾 膜上無菌落生長，以﹤1 報告菌數(shù)（每張濾膜過濾 1g、1ml 或 10cm2 供試品）, 或﹤1 乘以zui低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。

⒊  MPN 法 取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗確認的方法進行供試液制備和供試品接

種，所有試驗管在 30～35℃培養(yǎng) 3～5 天，如果需要確認是否有微生物生長，按 方法適應性試驗確定的方法進行。記錄每一稀釋級微生物生長的管數(shù)，從表 3 查對每 1g 或 1ml 供試品中需氧菌總數(shù)的zui可能數(shù)。

結果判斷 需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括真菌菌落

數(shù)）；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括細 菌菌落數(shù)）。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的細菌使霉菌及酵母菌的計數(shù)結 果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄 糖瓊脂培養(yǎng)基或選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基）進行霉菌和酵母菌總數(shù) 測定。使用選擇性培養(yǎng)基時，應進行培養(yǎng)基適用性檢查。若采用 MPN 法，測定結 果為需氧菌總數(shù)。

各品種項下要求執(zhí)行規(guī)定的微生物限度標準解釋如下： 101cfu：  可接受的zui大限度菌數(shù)為 20；

102cfu：  可接受的zui大限度菌數(shù)為 200；

103cfu：  允許可接受的zui大限度菌數(shù)為 2000：依此類推。 若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查結果均符合該品種項下的

規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，判供試品

不符合規(guī)定。

稀釋液、沖洗液及培養(yǎng)基

見非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查